Amostras seguras

1) Segurar o pintinho firmemente com os dedos no final do pescoço.

2) Com uma tesoura afiada seccionar o pescoço na região da primeira vértebra cervical.

3) Coloque logo em seguida o pescoço em um frasco de vidro pequeno (frasco de vacina), deixando o sangue escorrer pela lateral do frasco. Manter o frasco inclinado.

4) Deixar o frasco inclinado em repouso em local que não haja extremidades de temperatura, assim o sangue formará coágulo e ocorrerá a separação do soro.

5) Reserve os recipientes em local seguro e sem extremos de temperatura, assim o sangue formará coágulo e ocorrerá a separação do soro.

6) Havendo uma boa quantidade de soro, após 3 a 12 horas da coleta (dependendo da temperatura ambiente – quanto maior a temperatura, mais fácil e rápida será a separação), transfira o soro para outro recipiente limpo e esterilizado.

7) Feche a tampa do frasco firmemente para que não abra durante o transporte. Estes podem ser acondicionados em sacos plásticos devidamente identificados (lotes, idades, linhagem) e conservados sob refrigeração ou congelamento.

Para aves jovens ou adultas:

1) Retire o sangue da ave através de punção cardíaca ou venosa utilizando seringa descartável ( 3 ou 5 ml) e agulha descartável (30x7mm ou 30×8 mm ou similar).

2) Coloque o sangue em frasco limpo e esterilizado (eppendorf, tubos, frascos de vacina ou canudos) deixando-o escorrer pelas paredes lentamente e sem formar bolhas, caso contrário corre-se o risco a amostra hemolisar.

3) É suficiente a coleta de 2,5 – 3,0 ml de sangue para se obter um volume adequado de soro.

4) Nunca encha o frasco totalmente, pois desta forma não sobrará espaço para que o soro se separe, ocasionando a perda da amostra. Repetir os passos 5, 6 e 7 da coleta descrita anteriormente.

André Fonseca, da Simbios, diz que o Brasil é privilegiado no tange toda a sua estrutura avícola – é tecnicamente diferenciado na produção, na qualidade e também no diagnóstico, seja o gerado pelos laboratórios das próprias indústrias, seja o oferecido pelos vários prestadores de serviço de análises

Quantidade e transporte – O tamanho da amostragem, segundo reforça o diretor do laboratório gaúcho que aplica a biotecnologia em seus diagnósticos, depende de características do patógeno e das aves. “Micoplasmas e salmonelas, por exemplo, disseminam-se rapidamente, exigindo um menor número de amostras por lote para evidenciá-los. Via de regra, para testes confirmatórios de diagnóstico molecular, 10 a 30 amostras por lote são suficientes. Por outro lado, para evidenciarmos infecções recentes destes patógenos, em aves precoces, necessitaremos de um maior número de amostras – 60 a 100 amostras/lote”, exemplifica. “O tempo de permanência do patógeno na ave também é fator determinante na amostragem – quanto mais efêmera a infeccção, maior a necessidade de amostras/lote. Para reovírus e pneu-movírus, recomendamos o encaminhamento de 30 a 60 amostras/lote”.

Com relação ao envio de amostras, o principal cuidado é mantê-las refrigeradas evitando degradação/putrefação, garantem os técnicos dos laboratórios. “Não é indicado o congelamento das amostras de soro para o processamento dos testes de soroaglutinação rápida (Mg, MS, Salmonela), portanto deve-se enviar o mais rápido possível para o laboratório”, alerta Ana Cláudia, da Avipa. “Paras outros testes como HI, Elisa, soroneutralização, deve ser congelado e assim pode ser mantido por várias semanas/meses. O material deve ser sempre bem iden-tificado, diferenciando os lotes de forma que essa identificação não se perca ou apague. As amostras devem ser transportadas sempre sob refrigeração, evitando-se o uso de barras de gelo (dar preferência a gelos recicláveis ou frascos pet com água congelada).

Recomenda-se a coleta de 23 amostras de soros por lote para monitorias/desafios (principalmente para Elisa e HI). Porém, para diagnóstico de doenças de baixa prevalência, como micoplasma e salmonela, este número se eleva e o correto é a utilização de tabelas bioestatísticas”.

André Fonseca também recomenda alguns cuidados durante o envio das amostras. “Amostras de mesmo lote podem ser acondicionados em um mesmo frasco ou saquinho e a remessa deve ser feita da forma mais breve, em caixa térmica com gelo químico (o mesmo usado em transporte de vacinas). É importante lembrar também da preservação da amostra antes da remessa – o período deve ser o mais curto possível, com estocagem em geladeira”, ressalta.

Processo de análise de amostras avícolas

Estrutura brasileira – De uma forma geral, como estão os procedimentos de diagnósticos avícolas no Brasil? O País está preparado para atender casos emergenciais ou de doenças exóticas de forma eficiente?

Na opinião dos entrevistados, o Brasil segue os padrões internacionais de controle e monitorias de forma efetiva, porém, ainda precisa investir em pessoal e em infra-estrutura para criar equipes bem preparadas para agir em situações de emergência com maior eficácia. “Progredimos bastante em vários aspectos. Destaco como iniciativas de impacto o georreferenciamento no Rio Grande do Sul e seu papel na regionalização da avicultura, para contenção de epidemias. E no que se refere ao diagnóstico, há um esforço por parte do Ministério da Agricultura de disponibilizar Real Time PCR, técnica internacionalmente reconhecida para detecção e tipificação (diferencia cepas apatogênicas das patogênicas/ potencialmente patôgenicas, como tipos H5 e H7 do vírus de IA). No entanto, ainda não dispomos deste serviço essencial. Sequer temos previsão. E enquanto formos negativos para a presença do vírus pelos testes tradicionais, menor será nosso senso de necessidade e urgência para que esta condição mude”, avalia Fonseca. “Acho esta exposição desnecessária e perigosa. Mediante suspeita ou infecção do vírus de IA, necessitaremos de resultado rápido e preciso, para evidenciar de forma ágil e categórica o controle do vírus. O benefício será encurtar cada possível dia de exclusão do mercado internacional e o abalo no consumo (mercado nacional), que são danos irreparáveis”, alerta. “A monitoria de enfermidades exóticas para a avicultura do Brasil é um trabalho contínuo que não pode ser abandonado”, conclui Ana Cláudia.

Já o Ministério da Agricultura divulgou recentemente que investiu mais de R$ 40 milhões na modernização da rede de laboratórios oficiais, os Lanagros, e que a identificação das doenças de Newcastle e aftosa comprovam a eficiência dos serviços de defesa. “É justamente o trabalho de monitoramento dessas e de outras doenças que vem permitindo que estas sejam identificadas e controladas”, explicou o ministro Luiz Guedes Pinto.

Biotecnologia A biotecnologia vem sendo bastante aplicada em exames de diagnósticos humanos e na avicultura isto também já é uma realidade. “Principalmente como diagnóstico confirmatório, a partir de provas presuntivas de monitoria sorológica e de isolamento, graças aos seus diferenciais de elevada sensibilidade e especificidade”, argumenta André Fonseca, diretor executivo da Simbios. “Adicionalmente, esta tecnologia agrega informações de tipificação, distinguindo cepas vacinais e de campo, patotipos, sorotipos etc”. Segundo ele, a primeira grande vantagem da biotecnologia para a biosseguridade na avicultura refere-se ao fato de que a maioria das aplicações de diagnóstico molecular independe de cultivo de organismos. “Adicionalmente, todo o material biológico é inativado desde a primeira etapa de análises – extração de ácidos nucleicos. Conseqüentemente, não há exposição a organismos viáveis no decorrer da análise e nem produção de resíduos contaminantes decorrentes do processo. A maior vantagem é a possibilidade de trabalhar com material biológico inativado (inócuo) desde sua origem”.

Remessas Orientação para envio de material para exames sorológicos Não é indicado o congelamento das amostras de soro para o processamento dos testes de soroaglutinação rápida (Mg, MS, Salmonela), portanto deve-se enviar o mais rápido possível para o Laboratório. Paras outros testes como HI, Elisa, soroneutralização, deve ser congelado e assim pode ser mantido por várias semanas/meses. O material deve ser sempre bem identificado, diferenciando os lotes de forma que essa identificação não se perca ou apague. As amostras devem ser transportadas sempre sob refrigeração, evitando-se o uso de barras de gelo (dar preferência a gelos recicláveis ou frascos pet com água congelada). Recomenda-se a coleta de 23 amostras de soros por lote para monitorias/desafios (principalmente para Elisa e HI). Porém para diagnóstico de doenças de baixa prevalência, como micoplasma e salmonela, este número se eleva e o correto é a utilização de tabelas bioestatísticas. Orientação para envio de material para exames virológicos Os órgãos devem ser coletados de aves apresentando os sintomas (sempre no início dos sinais clínicos), de forma mais asséptica possível. O material coletado pode ser embalado em saco plástico limpo e mantido congelado e assim enviado, ou colocado em frascos com glicerina pura, forma em que também se conserva. Orientação para envio de material para isolamento/PCR de Micoplasmas Pode ser enviado material resfriado (traquéia) ou suabe de traquéia (em Caldo Frey ou a seco). Para isolamento, após a coleta o material deve ser enviado imediatamente, sob refrigeração e de forma segura para que os tubos não se quebrem durante o transporte, devendo chegar ao laboratório em até 24 horas. No caso de PCR para micoplasmas pode ser enviado amostras de traquéias ou suabes de traquéia. Orientação para envio de material para bacteriologia/micologia O material enviado para exame bacteriológico, quando perecível (aves mortas, órgãos, fezes, suabes em geral), deve ser mantido sob refrigeração. Material não perecível como ração, farinhas de origem animal, maravalha, palha, não tem necessidade de resfriamento. Para pesquisa de micotoxinas é indicado que seja resfriado ou congelado. Amostras de água para exame bacteriológico, devem ser coletadas em frascos estéreis (com tiossulfato de sódio em caso de águas cloradas) e chegar ao laboratório em até 24 horas após a coleta. Toda amostra de água deve ser resfriada logo após a coleta e ser assim mantida durante o transporte. Orientação para envio de material para histopatologia Todo material enviado para exame histopatológico deve ser conservado e remetido em formol 10%. Os fragmentos não necessitam ser grandes ( aproximadamente 1,5 cm3), porém devem ser representativos das lesões encontradas na necrópsia e das informações de anamnese. Para uma conservação ideal, a proporção de órgãos:formol: é de 1:3, evitando assim que os órgãos fiquem apertados, permitindo a ação do formol. Após a fixação em formol, os órgãos não necessitam de refrigeração, não devem ser congelados e podem ser armazenados por tempo indeterminado.